内生真菌对铁皮石斛种苗生长的影响

铁皮石斛(Dendrobium candidum Lindl.)为兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)多年生草本植物,是我国传统名贵濒危中药材,具有很高的药用和经济价值。铁皮石斛的种植和培育时,往往因缺少有益的内生真菌参与,导致组培苗移栽成活率低,种苗生长缓慢、品质较差,这种状况限制了铁皮石斛产业的规模化发展[1]。 内生真菌不同于菌根真菌只能定殖在植物的根部,其存在于植物组织的内部,部分存在于根、茎、叶之中,在植物衰老组织中产生孢子[2]。内生真菌与宿主通过长期的协同进化,与生存在宿主表面的表面菌相比,有本质性的区别,具有更稳定的生态功能[3]。研究发现,内生真菌能够与植物建立互惠共生的关系,提高植物对营养元素的吸收,促进植物的生长,提高植物对虫害、病害的抗性和对非生物胁迫的耐受性[4]。 本试验采用3种内生真菌与铁皮石斛种苗共生培养的方法,探讨内生真菌对铁皮石斛种苗生长的作用,旨在构建铁皮石斛共生培养体系,寻求能够有效促进铁皮石斛种苗生长、品质提升的新途径,为铁皮石斛仿生态栽培、生物肥(菌剂)的研究和应用等方面提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 材料 已移栽驯化的一年生铁皮石斛种苗,该种苗来自于杭州市临安成蹊农业科技开发有限公司所生产的天斛一号组培苗。将长势一致且生长健壮的铁皮石斛种苗种植于直径17.5 cm的花盆中。 1.2 处理设计 采用完全随机试验设计,共2个因子,分别为供试菌株(FC6、FC8、FC9)和接种体积分数(20%、40%、60%)。以无菌水浇灌为对照(CK),处理1～3接种FC6浓度分别为20%、40%和60%,处理4～6接种FC8浓度分别为20%、40%和60%,处理7～9接种FC9浓度分别为20%、40%和60%。每处理20盆。由于铁皮石斛具有较强的群体生长效应[5],本试验将种苗以每丛为单位开展研究和生物量测定。试验材料每盆3丛,共6～9株,重复3次。在常规施肥基础上(基肥:奥绿肥,每盆5～8颗,3～4个月施用1次。追肥:花宝二号,稀释1 000倍,春、秋季每半月喷施1次)进行菌液浇灌处理。其中,菌液共浇灌5次,间隔天数为15 d,每盆种苗每次浇灌菌液100 mL。共培养150 d后,调查统计各处理铁皮石斛种苗生物量,显微观察真菌侵染情况。另外从处理组和对照组种苗中随机抽取10盆进行重分离真菌,并鉴定。 1.3 金钗石斛内生真菌分离纯化 从金钗石斛较老的根部向上剪取4～6 cm的小段,洗洁精刷洗干净,流水下冲洗1 h;在超净工作台中用75%乙醇消毒1 min、0.1% HgCl2消毒6 min,最后再用无菌水冲洗3次[6]。无菌滤纸吸干根段表面水分后,先用剪刀把根段两端剪掉约3 mm,然后再剪成约1 cm长的小段,接于PDA(马铃薯、葡萄糖)固体培养基上,进行真菌的分离、纯化。另将最后一次冲洗过的无菌水接入PDA固体培养基上作对照,若表面无杂菌产生,表明金钗石斛根部表面消毒彻底。 1.4 内生真菌形态观察鉴定 将1.3节分离的菌株接种于PDA固体培养基上,然后放置在恒温培养箱内,暗培养温度设置为26 ℃。培养7～15 d后,通过菌落特征和显微观察初步鉴定筛选菌株。 1.5 内生真菌分子鉴定 将发酵培养(PDA液体培养基)的菌丝球用无菌纱布过滤,再用无菌滤纸吸干后放入研钵中,加入液氮快速研磨至粉末状,用CTAB法提取真菌基因组DNA,核酸分析仪检测DNA纯度和浓度。分别以通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCT GCGG-3′)和ITS4(5′-TCC