F-box结构域参与FBXO39蛋白对MCF-7细胞增殖的调控

作者:李芳;刘罗根;黄果;戈欣;欧阳靖霖;章运生; 刊名:中国病理生理杂志 上传者:徐建军

【摘要】目的:探讨F-box结构域对FBXO39蛋白调控MCF-7细胞增殖的影响。方法:以MCF-7细胞cDNA文库为模板,采用PCR方法扩增FBXO39基因的全长cDNA序列并克隆到真核表达载体pEGFP-C2;以pEGFP-FBXO39质粒为模板,构建pEGFP-FBXO39ΔF(F-box结构域缺失)质粒;将重组质粒转染MCF-7细胞后,Western blot验证FBXO39和FBXO39ΔF的表达水平;激光共聚焦显微镜观察FBXO39和FBXO39ΔF的亚细胞定位情况;免疫荧光检测内源性FBXO39在MCF-7细胞中的定位。MTT和EdU试剂盒检测MCF-7细胞的增殖情况;流式细胞术检测MCF-7细胞周期;免疫组化检测FBXO39在乳腺癌及其癌旁组织中的表达差异。结果:本研究成功构建了pEGFP-FBXO39和pEGFP-FBXO39ΔF真核表达载体。F-box结构域对FBXO39蛋白的细胞定位没有影响。FBXO39促进了MCF-7细胞的增殖,而FBXO39ΔF对MCF-7细胞增殖无明显影响。FBXO39高表达于乳腺癌组织。结论:F-box结构域对FBXO39蛋白的细胞定位没有产生明显影响,但对维持FBXO39的生物学作用至关重要。FBXO39可能与乳腺癌的发生相关。

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F-box蛋白是一类含有F-box结构域的蛋白家族[1]。F-box结构域位于F-box蛋白的N端,与SKP1和cullin蛋白结合成SCF(SKP1-CUL1-F-box)E3泛素连接酶复合体[2-3]。F-box蛋白的C端主要参与特异性底物蛋白的识别。F-box蛋白的功能主要与肿瘤发生发展[4]、细胞周期调控[5]、上皮细胞间质转化[6]、细胞代谢[7]和生殖发育[8-9]等过程相关,例如F-box蛋白家族成员FBXO31能够选择性降解cyclin D1来诱导G1期的阻滞,但对cyclin B1和周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases, CDKs)以及CDK抑制因子p14和p27等没有影响,其中cyclin D1正是G1/S期的关键调控因子;另外两种F-box蛋白家族成员FBXO4和FBXW8也能够介导cyclin D1的降解来阻滞细胞周期G1进程[6]。 FBXO39是F-box蛋白家族成员之一,目前在乳腺癌、结肠癌、甲状腺未分化肉瘤、卵巢和肺癌均发现其表达[10]。RT-PCR检测发现其高表达于成年男性睾丸组织中,而在其它大部分正常器官组织中表达缺失或低表达。因此,FBXO39被认为是一种新的肿瘤/睾丸抗原[11]。在骨肉瘤U-2OS细胞中,敲减FBXO39的表达能够抑制细胞的增殖,并促进肿瘤细胞凋亡[12]。在乳腺癌中,RT-PCR检测发现FBXO39在2种乳腺癌细胞系(MCF-7和MDA-MB-231)和临床乳腺癌标本中都有表达,但在正常乳腺组织中表达缺失[13]。因此,FBXO39被认为参与了乳腺癌的发生,但其具体机制目前尚不清楚。已知,F-box结构域对于F-box蛋白的分子功能起到了至关重要的作用[1]。F-box结构域对FBXO39蛋白的细胞定位和功能是否产生影响呢?细胞定位的改变对FBXO39蛋白的功能是否有影响呢?本课题采用缺失突变的方法,构建F-box结构域缺失的真核表达载体pEGFP-FBXO39ΔF及其野生型pEGFP-FBXO39转染在乳腺癌MCF-7细胞,探究F-box结构域对FBXO39蛋白的细胞定位及功能的影响。 材 料 和 方 法 1 材料与试剂 pEGFP-C2质粒、大肠杆菌DH5α和乳腺癌MCF-7细胞由本实验室保存;限制性内切酶Hind III和Kpn I,高保真DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、Dpn I酶及PNK磷酸化酶均购自Fermentas;DNA纯化试剂盒、无内毒素质粒提取试剂盒和逆转录试剂盒等购于天根公司;转染试剂Lipofectamine 2000和RNA提取试剂(TRIzol)购自Invitrogen;FBXO39多克隆抗体以及山羊抗兔II抗购于Sigma;Alexa Fluor 488标记的荧光II抗购于Jackson;DAPI购于碧云天公司;EdU试剂盒购于恒宇生物公司。 2 主要方法 2.1 引物设计与合成 使用Primer 5.0软件设计FBXO39和FBXO39ΔF载体构建的上、下游引物,以及用于RT-PCR检测的上、下游引物,并由Invitrogen合成(序列见表1)。 2.2 目的基因的扩增 以MCF-7细胞cDNA为模板,PCR扩增FBXO39基因的ORF序列。反应体系为2×Phusion Master Mix 25 μL,上、下游引物各2 μL,cDNA模板 1 μL,ddH2O 20 μL。反应条件为 98 ℃ 30 s;98 ℃ 10 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s,共30个循环;72 ℃ 5 min。取3 μL PCR

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