REGγ基因异常表达与甲状腺乳头状癌发生、发展相关性分析

作者:涂媛;何林;姚胜平;章培; 刊名:转化医学杂志 上传者:楼学祯

【摘要】目的探究REGγ基因异常表达与甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)发生、发展相关性。方法收集2015年1月—2018年6月成都市第二人民医院手术切除甲状腺标本103例,采用实时定量PCR法检测REGγmRNA,采用免疫组织化学染色检测REGγ蛋白的表达,并与临床病理资料对比分析。结果 PTC组织中REGγmRNA表达水平为(3. 58±1. 60),REGγ蛋白阳性率为66. 10%,均高于甲状腺滤泡性腺瘤、结节性甲状腺肿及癌旁正常甲状腺组织的表达,差异比较有统计学意义(P<0. 05);肿瘤直径<2 cm患者REGγmRNA表达水平及REGγ蛋白阳性率显著高于肿瘤直径≥2 cm患者,无淋巴结转移患者REGγmRNA表达水平及REGγ蛋白阳性率显著高于淋巴结转移患者,差异比较有统计学意义(P<0. 05); PTC组织中REGγmRNA检测与REGγ蛋白表达呈正相关关系(r=0. 485,P<0. 05)。结论 REGγ基因表达与PTC的发生、发展相关,可为肿瘤恶性程度、转移情况及预后评估提供一定指导。

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REGγ基因属REG/11S蛋白酶体激活因子家族成员,也被称为PSME3或PA28γ,可结合并激活20S蛋白酶体,以非泛素或非ATP依赖方式促进类固醇受体辅助活化因子-3、p21、p16等靶蛋白降解[1]。REGγ基因在结肠癌、肺癌、胃癌等多种恶性肿瘤组织中高表达,或有转移抑制作用[2-3],但针对其在甲状腺癌中表达的研究国内相对鲜见。本研究分别检测REGγ基因在正常甲状腺组织、甲状腺良性病变组织及甲状腺乳头状癌(papillary thyroid car-cinoma,PTC)组织中的表达情况,分析REGγ基因异常表达与PTC发生、发展的相关性。1材料与方法1. 1一般资料经患者知情同意,签署知情同意书。收集2015年1月—2018年6月成都市第二人民医院手术切除甲状腺标本103例,经临床病理明确诊断,其中PTC 59例,未分化癌(undifferentiated carci-noma,UTC) 6例,滤泡癌(follicular carcinoma,FTC) 4例,滤泡性腺瘤(follicular adenoma,FA) 19例,结节性甲状腺肿(nodular goiter,NG) 15例;男性患者32例,女性患者71例;年龄20~74岁,中位年龄45岁。PTC患者肿瘤直径<2 cm者46例,≥2 cm者13例,伴淋巴结转移21例。距病灶2 cm处取癌旁组织14例作为正常对照。部分标本离体30 min内置于-80℃超低温冰箱中保存,剩余组织经10%中性福尔马林缓冲液固定,石蜡包埋切片。1. 2实时定量-PCR(real-time PCR,RT-PCR)法检测REGγmRNA表达(1)根据TRIzol试剂盒(美国Gibco-BRL公司)说明书提取总RNA,分析纯度、含量,逆转录合成cDNA。使用Primer 5软件设计REGγ引物,以5'-GCCTGTATCAAAGTCACCAAA-3'为上游引物,5'-CAGGAGCAGGAAAGCAAAG-3'为下游引物,产物273 bp。每份标本以β-actin为内参对照,以5'-CTCATTGCCAATGGTGST-3'为上游引物,5'-ACCGAGCGCGGCTACAGC-3'为下游引物,产物170 bp。引物均由深圳华大基因公司设计完成。同管扩增,总反应体系12. 5μL。反应条件:95℃预变性5 min; 95℃变性30 s; 57℃退火30 s; 72℃延伸45 s,共32个循环; 72℃再延伸5 min; 4℃保存。(2)取10μL PCR扩增产物,1. 5%琼脂糖凝胶电泳;置紫外灯下拍照行面积灰度扫描,将密度表示其表达量;计算目的基因RT-PCR产物光密度容积与β-actin基因RT-PCR产物光密度容积的比值,将其作为目的基因mRNA的相对含量。(3)使用3100型全自动遗传分析仪测定PCR产物序列,并通过Blast程序将结果与GenBank数据库序列进行同源性比较。1. 3免疫组化检测REGγ蛋白表达(1)参照试剂操作说明书,使用EnVision两步法用乙二胺四乙酸缓冲液微波抗原修复11 min。采用扁桃体作为已知阳性组织切片做阳性对照,采用磷酸缓冲盐溶液代替一抗做阴性对照。抗体及EnVision试剂盒均购自上海长嘉生物技术有限公司,DAB显色液购自福州迈新生物技术开发有限公司。(2)结果判定:REGγ蛋白定位于细胞浆,呈棕黄至棕褐色染色为阳性细胞。采用网格计数法判定,随机选取10个不重复视野,400倍光学显微镜下观察免疫组化染色的阳性蛋白表达。染色强度评分:无着色计0分,淡黄色染色计1

参考文献

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