重组突变巴曲酶酶动力学及活性分析研究

作者:李娜;兰海英;康乐;陈宏超;徐梅; 刊名:蛇志 上传者:麻德旺

【摘要】目的对重组突变巴曲酶进行酶动力学初步研究,并建立一种蛇毒类凝血酶活性测定方法。方法使用可控温(37℃)紫外分光光度计,采用酶动力学测定法,测定重组突变巴曲酶的米氏常数,优化活性测定方法的反应时间和线性范围,验证此方法精密度,并用发色底物法与血浆凝集法同时测定不同蛇种来源的类凝血酶活性。结果重组突变巴曲酶的米氏常数(37℃)Km值为256.28μmol/L、Vm值为0.005 077μmol/min。该法呈现相应的剂量关系曲线,反应时间优选为0~20 min,线性范围优选为1~16.8 nmol/L,拟合度R~2≥0.99,方法精密度的变异系数≤5.0%。两种不同方法测定不同蛇种来源类凝血酶的活性单位比例范围为3.3~3.7(发色底物法/血浆凝集法),比例关系一致。结论建立的蛇毒类凝血酶活性测定方法拟合度优,精密度高,可测定不同来源的类凝血酶活性,并可替代传统血浆凝集活性测定法。

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巴曲酶也叫蛇毒类凝血酶(Snake venom thrombin-like enzymes,SVTLEs),是从矛头蝮蛇(Bothrops atrox)和茂基蝮蛇(Moojeni)等蛇的蛇毒中提取的一类丝氨酸蛋白酶[1-2]。SVTLEs通过裂解蛋白的肽键在血液凝集、纤溶系统、血小板活化、免疫系统和炎症等方面扮演了重要的角色[3-4]。巴曲酶的凝血机制与凝血酶不同,凝血酶是通过裂解纤维蛋白原A链和B链,使纤维蛋白原转化为纤维蛋白,而巴曲酶仅作用于纤维蛋白原的A链,释放出纤维蛋白肽A,从而快速地将血液中的纤维蛋白原转变为纤维蛋白,这些纤维蛋白就能聚集成疏松的栓子来封闭伤口,实现快速止血的效果[5]。 重组突变巴曲酶(recombinant mutant batroxobin,rmBAT)是通过DNA重组技术,采用毕氏酵母菌偏好密码子,编码除45位氨基酸突变之外,其余氨基酸与巴西矛头蝮蛇(Bothrops atrox)天然巴曲酶的氨基酸序列一致的重组蛋白。突变的氨基酸位点是将天然巴曲酶基因序列中第45位的Arg突变为Lys,避免了毕赤酵母分泌的Kex2蛋白酶对发酵液中所表达的巴曲酶的降解[6]。该蛋白由231个氨基酸组成,含有12个半胱氨酸,6对二硫键,相对分子量为31.0 kD,等电点为6.3[7]。本研究主要是应用rmBAT建立一种测定SVTLEs的活性方法。 1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器 rmBAT、矛头蝮蛇类凝血酶、尖吻蝮蛇类凝血酶和白眉蝮蛇类凝血酶均由辽宁远大诺康生物制药有限公司(诺康生物)生产;发色底物S2238(H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl)购自意大利Chromogenic公司;人质控血浆购自德国MDC公司;其他试剂均为国产或进口分析纯。Evolution220紫外可见分光光度计,购自美国Thermo fisher公司。 1.2 方法 1.2.1 rmBAT活性测定方法米氏常数测定 用50 mmol/L pH7.4三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris-HCl)将rmBAT稀释至100 nmol/L,用去离子水将底物S2238稀释至8个浓度(0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2.4 mmol/L)。反应时,在1 ml比色皿中加入60 μl rmBAT和100 μl不同浓度的S2238,再加入Tris-HCl缓冲液840 μl混匀,在温控37 ℃的紫外可见分光光度计中孵育5 min,然后在405 nm波长测定吸光光度(A)值,每30秒测定1次,共10 min。得到的数据以米氏方程双倒数法(Lineweaver-Burk)作图,再根据米氏方程推导的“公式1”求得米氏常数[8]。 式中v为反应初速度(nmol/min);Vm为最大反应速度(nmol/min);S为底物浓度(mol/L);Km为米氏常数(mol/L)。 1.2.2 反应时间选择 随机抽取诺康生物生产留样的批号为100 101的rmBAT标准品(纯度>99%),用Tris-HCl缓冲液将rmBAT稀释至100 nmol/L,取60 μl置于1 ml比色皿中,再加入100 μl 1 mmol/L底物S2238,最后加入840 μl Tris-HCl缓冲液混匀。在37℃下孵育5 min,然后每30秒测定A405 nm值,共100 min。实验得到的数据以时间(min)为横坐标,A值对时间的变化率(△A405 nm/s)为纵坐标作图,并分析结果。 1.2.3 线性范围选择 随机抽取诺康生物生产留样的批号为100101的rmBAT标准品,用T

参考文献

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