多肽~(301)LARSLKT~(307)对斑马鱼胚胎早期心脏发育的影响

作者:胡银;刘恒;严湘芸;庄斌;陈文娟;王星云;韩树萍;余章斌; 刊名:安徽医科大学学报 上传者:罗燕子

【摘要】目的探究踝蛋白-1(TALIN-1)来源的多肽~(301)LARSLKT~(307)对斑马鱼胚胎心脏发育的影响。方法①利用Pubmed、Uniprot和ProtParam tool在线生物信息学分析网站,对多肽~(301)LARSLKT~(307)的保守性、理化特性和其前体蛋白进行分析;②在斑马鱼胚胎1细胞期,镜下显微注射多肽~(301)LARSLKT~(307)后,计数36、48及72 h斑马鱼的心率并观察对斑马鱼心包发育的影响;③利用在心脏房室特异表达的基因探针cmlc2、amhc及vmhc原位杂交技术显色后检测心脏的形态;④利用实时定量PCR(qPCR)检测斑马鱼心脏发育相关基因amhc、vmhc、mef2c和nkx2.5的表达变化。结果①多肽~(301)LARSLKT~(307)是位于其前体蛋白TALIN-1的B41结构域的亲脂性肽;②实验多肽注射组的斑马鱼胚胎的心率在36、48及72 h均出现降低(P<0.05),且心包出现明显水肿;③实验多肽注射组斑马鱼胚胎48 h环化未能完成,对照肽注射组及野生型组环化正常;④qPCR检测显示,实验多肽注射组的斑马鱼心脏发育相关基因amhc、vmhc、mef2c、nkx2.5较野生型组均有不同程度下降。结论多肽~(301)LARSLKT~(307)可影响斑马鱼胚胎期心脏的发育及功能。

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法洛四联症是常见的复杂先天性心脏病,其发生率约占活产婴儿的4‰,死亡率则达5%以上,且需二次手术的患儿高达30%[1],给家庭和社会带来沉重的负担。早期诊断及早期治疗可以显著提高患儿的存活率。本课题组早期利用气-液联动质谱技术,对法洛四联症流产胎儿心肌组织进行多肽组学进行分析[2],发现TALIN-1结构域来源的多肽301LARSLKT307含量较对照组有显著差异,提示这条多肽可能与心脏的发育及功能相关。为了验证此假设,该研究用显微注射技术将多肽注射入斑马鱼受精卵,构建胚胎发育模型,研究在此条件下该多肽对心脏发育的影响。 斑马鱼的心脏发育,在基因表达、形态发生以和生理特性上均与哺乳动物高度相似[3]。并且,斑马鱼胚胎在体外受精与发育、胚胎透明、产量大,且可不完全依赖于心血管系统存活[4]。斑马鱼心脏发育迅速,72 h即可完成胚胎期心脏发育[5],相当于人类妊娠8周内心脏发育的过程。这些优势使得斑马鱼成为心脏发育研究的重要模型。该研究从多肽对斑马鱼的生长发育过程的影响入手,为阐明多肽与胚胎心脏发育畸形的内在机制提供理论依据和线索,以期望能够对人类先天性心脏病的诊断及治疗的研究方面有所帮助。 1 材料与方法 1.1 实验动物 Tubingen品系野生型成年斑马鱼购自南京大学模式动物研究所,雌雄斑马鱼分缸饲养,每日予光照14 h、黑暗10 h的人工光照周期;成年斑马鱼予脱壳丰年虫喂食3次/d。实验前12 h,将成年雌雄斑马鱼等比例配对移入交配缸,并用挡板分开,次日亮灯前抽取挡板,光照刺激促排卵,15 min后收集胚胎。收集的胚胎置于28.5 ℃恒温培养箱中,及时更换培养液并挑出死亡的胚胎,防止影响其他胚胎发育。 1.2 试剂与仪器 1.2.1 主要试剂 多肽及对照随机乱序肽均委托北京泽溪源公司化学合成,序列分别为LARSLKT和ALKTLRS;原位杂交RNA探针:心肌肌球蛋白轻链2型基因(cardiacmyosin light chain-2,cmlc2)、心室肌球蛋白重链基因(ventricular myosin heavy chain,vmhc)、心房肌球蛋白重链基因(atrtal myosin heavy chain,amhc)由南京市妇幼保健院医学研究中心赠送;Tween-20购自美国Amresco公司;甲酰胺购自美国Promega公司;酵母RNA、多聚甲醛、蛋白酶K、色素抑制剂、马来酸、左旋咪唑、苯甲酸、苯甲醇、甲基纤维素、三卡因均购自美国Sigma公司;封闭剂、地高辛抗体、地高辛标记的UTP、显色液、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、对甲苯胺蓝(BCIP)均购自德国Roche公司;TRIzol购自美国Invitrogen公司;动物组织总RNA提取试剂盒购自北京天根公司;反转录试剂盒及SYBR Premix Ex TaqTM II购自日本TAKARA公司;余试剂均为国产分析纯。 1.2.2 主要试验仪器 隔水式电热恒温培养箱(型号:PYX-DHS)购自上海跃进公司;Olympus体式显微镜(型号:MVX-TV0.63XC)购自日本Olympus公司;徕卡立体显微镜(型号:MZ16F)购自英国Leica公司;原位杂交炉(型号:HL-2000 Hybrilinker)购自美国UVP公司;Real-time PCR仪(型号:ViiA 7)购自美国UVP公司。 1.3 实验方法 1.3.1 实验分组与多肽的显微注射 将1次所产的胚胎随机分为3组,野生型组(WT)、实验多肽注射组(PEP)、对照多肽注射组(NC)。PEP组在45 mi

参考文献

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