氟化物对FRTL细胞甲状腺激素代谢相关基因表达的影响

作者:江鹏;张维东;柴春彦;肖睿;丁明星;刘国艳 刊名:中国兽医学报 上传者:何国平

【摘要】为探讨氟对FRTL细胞甲状腺球蛋白(TG),甲状腺过氧化物酶(TPO)和钠碘转运体(NIS)基因表达的影响,传代培养FRTL细胞,在对数生长期用氟化钠处理,使培养液中的氟浓度分别为20、10、5、2.5、1.25 mg/L,同时设空白对照细胞。培养72 h后收集细胞;采用半定量RT-PCR分析FRTL细胞TG、TPO、NIS mRNA和-βactin表达水平。试验结果表明,与对照细胞相比,较低浓度氟化钠处理的FRTL细胞TG基因表达量代偿性升高,随氟质量浓度增加(5.0 mg/L以上),TG表达量显著降低(P<0.05);各个浓度氟化钠处理的FRTL细胞TPO、NIS基因表达量均下降或显著下降(P<0.05)。由此可知,氟化物降低了甲状腺细胞TG、TPO、NIS基因表达水平,造成甲状腺摄取和利用碘、甲状腺激素合成、贮存、分泌功能障碍,进而导致甲状腺结构和功能异常。

全文阅读

氟化物能导致动物甲状腺结构损伤,引起甲状腺组织肿大以及合成和分泌甲状腺激素(TH)功能障碍[1-3]。目前,氟化物导致甲状腺损伤的复杂作用机理还没有阐明。已知甲状腺球蛋白(TG)、甲状腺过氧化物酶(TPO)、钠碘转运体(NIS)在甲状腺激素的合成、分泌以及维持甲状腺正常结构过程中发挥着重要作用[4-5]。其中,TG是碘化酪氨酸和甲状腺激素合成的载体,也是碘和甲状腺激素的贮存形式[6];TPO是维持甲状腺功能正常的关键酶,促进碘的活化、酪氨酸的碘化和偶联形成具有生物活性的甲状腺激素[7];NIS介导和促进甲状腺细胞摄取碘[8]。这些因子是合成和分泌甲状腺激素以及决定甲状腺功能的关键蛋白,其编码基因表达正常与否,直接影响到甲状腺结构和功能。本试验用氟化物处理体外培养的大鼠甲状腺细胞系(Fisherratthy-roidcellline,FRTL)细胞,观察氟化物对编码FRTL细胞TG、TPO、NIS蛋白基因表达的影响,从而在一定程度上为揭示氟引起甲状腺结构和功能损伤的分子机理提供理论依据。1材料与方法1.1主要仪器和试剂3111型CO2细胞培养箱,美国产;细胞超声破碎机,宁波新芝生物科技公司;分光光度计,Eppendorf;MIAS-2000型凝胶成像分析系统,Vilber-Lourmat公司;PTC-200PCR仪,Bio-Rad公司;RPMI-1640培养基和青链霉素,GIB-CO公司;胎牛血清,Hyclone公司;L-谷氨酰胺,吉诺生物医药技术有限公司;牛TSH,猪胰岛素,转铁蛋白和氢化考的松,Sigma公司;氟化钠(分析纯,上海凌峰);RT-PCR试剂盒,TaKaRa,Oligo(dT)18,TaKaRa;PCR引物,上海生工生物工程技术服务公司提供;DNAMarker,上海捷瑞生物有限公司提供。1.2FRTL细胞培养采用ATCC提供的FRTL细胞(CRTL-1468)传代培养,完全培养基配方由ATCC提供,RPMI-1640培养基,10%的胎牛血清(Hyclone),青链霉素在培养基中均为100U/mL,牛TSH为0.01U/L,猪胰岛素为10mg/L,转铁蛋白10mg/L,氢化考的松3.5mg/L,每100mL完全培养基加1mLL-谷氨酰胺,在培养FRTL细胞前1d制备完全培养基,完全培养基过滤分装,4备用;细胞置37,5%CO2细胞培养箱培养,及时观察细胞生长情况。1.3氟化钠处理FRTL细胞和细胞的收集保存细胞长满后(细胞存活率95%以上),本试验在细胞对数生长时加入不同水平的氟,细胞贴壁情况良好,细胞存活率95%以上,保证氟攻毒试验的正确性和合理性。将细胞接种到6孔培养板中培养,接种数目约1.0106个/mL,定时观察细胞生长情况,当细胞长至50%~60%时用氟化钠(Sodiumfluoride,NaF)处理,使NaF在培养基中质量浓度分别为20、10、5、2.5、1.25mg/L,同时设空白对照细胞。72h后收集FRTL细胞置无RNA酶EP管,-80冰箱保存。1.4FRTL细胞RNA提取和检测每管细胞(细胞密度5.0107个/mL)加1mL的Trizol试剂,反复冻融,超声破碎5次,补加500LTrizol充分作用细胞,提取细胞中的总RNA,80%的乙醇洗涤2次,干燥后DEPC水稀释,分光光度计检测230、2602、80nm的D值,计算RNA的浓度,D260/D280和D230/D260比值,RNA变性电泳检测RNA质量。1.5合成cDNA和PCR反应以2g的总RNA为模板,Oligo(dT)18作引物,使用AMV逆转录酶,反应体

参考文献

引证文献

问答

我要提问