张家口地区回族中小学生甘露糖结合凝集素基因外显子I52位密码子基因频率特征分析:与汉族健康人群的对照

资源类型:pdf 资源大小:207.00KB 文档分类:医药、卫生 上传者:钟希明

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【作者】 韩瑞  闫志宏  赵铁军 

【关键词】凝集素类 聚合酶链反应 基因频率 汉族 回族 

【出版日期】2005-08-21

【摘要】目的:了解张家口地区回族中小学生甘露糖结合凝集素基因外显子I52位密码子基因突变频率。方法:①于2003-08选择张家口地区康保县处长地乡回族中学和米家营小学回族学生100人,男61人,女39人。于2003-10张家口市中心血站献血人员169人作为对照,男122人,女47人,均为汉族。所有纳入对象均为健康人群,且对检测指标均知情同意。②进行甘露糖结合凝集素外显子I52位密码子基因突变的序列特异性引物聚合酶链式反应检测。③计数资料差异比较采用χ2检验。结果:①回族人群100人,汉族人群169人,均进入结果分析,无脱落者。②回族中小学生100人,野生型为100人(100%);基因频率CGT为1。汉族人群169名汉族人52位密码子的野生型为161人(95.3%),突变杂合型为8例(4.7%),基因频率分别为CGT为0.9763;TGT为0.0237。回族中小学生甘露糖结合凝集素外显子I52位密码子基因度明显低于汉族人群(P<0.05)。结论:血清甘露糖结合凝集素外显子I52位密码子的点突变频率在不同的民族略有差异,汉族突变度显著高于回族。

【刊名】中国临床康复

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0引言甘露糖结合凝集素基因多态性以及结构的突变可引起人体调理吞噬缺损犤1,2犦。采用已建立甘露糖结合凝集素基因外显子I52位密码子突变检测的方法犤3,4犦,即序列特异性引物聚合酶链式反应,用该方法测定张家口地区回族中小学生甘露糖结合凝集素基因外显子I52位密码子的情况。1对象和方法设计:以回、汉两族为观察对象,组间对照,队列研究。单位:河北北方学院生物化学教研室。对象:于2003-08选择张家口地区康保县处长地乡回族中学和米家营小学回族学生100人,男61人,女39人;年龄9~17岁,均为健康人群。于2003-10张家口市中心血站献血人员169人作为对照,男122人,女47人,年龄23~47岁,均为健康人群,且为汉族。所有纳入对象对检测指标均知情同意。设计、实施、评估者:实验设计为河北北方学院生物化学教研室,指标检测、试验具体实施及评估在学院实验中心进行,由全部作者共同参与完成,均受过专业培训,评估过程采用盲法。方法:设备:低温高速离心机(德国,hearus);梯度PCR仪(德国,Eppendorf);凝胶图像分析系统(珠海,黑马);电泳仪(北京,六一),低温冰柜(日本,三洋)紫外可见光分光光度计(756M C,上海)试剂:TaqDNA聚合酶(1×106U/L,M BI),10×缓冲液(随酶赠送),脱氧核苷三磷酸(Prom ega),琼脂糖(Sigm a),红细胞裂解液,DNA提取液,Tris-EDTA-Na2缓冲液,Tris-乙酸电泳缓冲液,DNA分子量标志物(DL2000,大连宝生物公司)。方法:标本的收集:收集所有纳入的回族健康人康以及汉族健康人群的静脉血标本5m L,乙二胺四乙酸二钠抗凝(抗凝比例为10∶1),分离血浆,-86℃保存,供测定甘露糖结合凝集素含量,细胞成分用盐酸胍7。法提取DNA。染色体DNA的提取:取抗凝血的细胞成分200μL,用红细胞裂解液溶解红细胞,以5000r/m in速度离心5m in,弃上清,离心2次后,用生理盐水平衡,以12000r/m in速度离5m in,去上清,应用胍盐酸法提取DNA,根据剩余体积依次加入不同体积的提取液(包括7.5m ol/L胍盐酸、20g/L蛋白酶K、100g/L的十二烷基磺酸钠等),70℃水浴10m in,振荡混匀,再次离心15m in,收集上清,乙醇沉淀DNA,TE溶解,-20℃保存,进行聚合酶链反应。序列特异性引物聚合酶链式反应:用如下所述方法对所收集100例回族中小学生及对照组169例健康汉族人的Exon152位密码子碱基进行分析。引物合成:由大连宝生物公司合成。52位密码子突变型:引物1为5’-CTG CAC CCAGAT TGT AGG ACA GAG-3’,引物2为5’-TCT CCCTTG GTG CCA TCA CA-3’;52位密码子野生型:引物1为5’-CTG CAC CCA GAT TGT AGG ACA GAG-3’,引物3为5’-TCT CCC TTG GTG CCA TCA CG-3’。内对照人类生长激素H GH-1S:5’-TGC CTT CCC AACCAT TCC CTT A-3’;内对照人类生长激素H GH-2as5’-CCA CTC ACG GAT TTC TGT TGT GTT TC-3’。扩增体系及参数设置:扩增体系为25μL,其中10×缓冲液(含有犤NH4犦2SO4)2.5μL,脱氧核苷三磷酸(2.5m m ol/L)2μL,引物1(10pm ol/L)2.5μL,引物2(10pm ol/L)2.5μL或引物3(10pm ol/L)2.5μL,内对照人类生长激素H GH-1s和内对照人类生长激素H GH-2as分别为(10pm ol/L)2.5μL TaqDNA酶2μL(1×106U/L),M g2+1.6m m ol/L1.6μL,模板2μL灭菌三蒸水补足总体积。预变性96℃1m in,变性96℃25s,70℃45s,延伸72℃45s(循环5次),变性96℃25s,65℃50s,延伸72℃45s(循环21次),变性96℃25s,55℃60s,延伸72℃2m in(循环4次)。扩增产物分析:扩增产物用Tris-乙酸缓冲液配制含0.5m g/L溴化乙锭15g/L的琼脂糖凝胶电泳,电泳4V/cm,30m in;DNA分子量标志物作为参照,对扩增产物进行分析,可有3种情况:Exon152位密码子野生型(引物1/引物3有扩增产物);Exon I52位密码子纯合子突变型(引物1/引物2有扩增产物);Exon I2.2甘露糖结合凝集素52位密码子的点突变情况汉族人群甘露糖结合凝集素52位密码子的点突变情况野生型为161人(95.3%);突变杂合型为8人(4.7%),突变纯合子型(TGT/TGT)0人,基因频率分别为CGT为0.976;TGT为0.024。回族人群甘露糖结合凝集素52位密码子的点突变情况:野生型为100人(100%),基因频率CGT为1,TGT为0。两组间差异明显(χ2=4.879,P<0.05)。3讨论有研究表明,基因多肽性在多种疾病的发展中具有重要作用犤5,6犦。大多数研究显示,血清甘露糖结合凝集素低水平或缺失,无论是单独或是联合其他方面的相关的缺陷都可能会导致调理吞噬缺陷,这与甘露糖结合凝集素在宿主防御方面发挥着重要作用有关。血清中甘露糖结合凝集素的水平主要由其编码基因结构决定,并受启动子区域基因的活性调节。已经发现在5’启动子区域有7个点突变,在外显子1有3个突变位点,编码区域上游突变会改变甘露糖结合凝集素的血清浓度,有可能使其产物不能够多聚化而进一步激活补体的甘露糖结合凝集素途径,因为甘露糖结合凝集素功能的发挥依赖于合适的甘露糖结合凝集素单体的多聚化水平,而甘露糖结合凝集素的血清水平和其结构则影响甘露糖结合凝集素功能的发挥。其中外显子1的52位、54位和57位密码子突变会干扰甘露糖结合凝集素多肽进一步组装成功能性多聚体,进而降低血清中功能性甘露糖结合凝集素的含量。用序列特异性引物聚合酶链反应方法就张家口地区回族中小学生甘露糖结合凝集素基因外显子I52位基因频率进行调查、分析,在所检测到的100例回族中小学生中,野生型为100人(100%),基因频率分别为CGT为1,TGT为0。对照组169例健康汉族人中,野生型(CGT/CGT)为161人(95.27%),突变杂合子型(CGT/TGT)为8例,占4.73%。突变纯合子型(TGT/TGT)无。基因频率分别为CGT为0.9763,TGT为0.0237。本实验结果显示外显子I52位密码子的点突变频率不高,不同民族略有差异,汉族突变度显著高于回族;回族中小学生甘露糖结合凝集素52位密码子基因频率显著高于与汉族人群。张家口地区回族中小学生甘露糖结合凝集素基因外显子I52位密码子基因频率特征分析:与汉族健康人群的对照@韩瑞$河北北方学院生物化学教研室!河北省张家口市075029 @闫志宏$河北北方学院生物化学教研室!河北省张家口市075029 @赵铁军$河北北方学院生物化学教研室!河北省张家口市075029凝集素类;;聚合酶链反应;;基因频率;;汉族;;回族目的:了解张家口地区回族中小学生甘露糖结合凝集素基因外显子I52位密码子基因突变频率。方法:①于2003-08选择张家口地区康保县处长地乡回族中学和米家营小学回族学生100人,男61人,女39人。于2003-10张家口市中心血站献血人员169人作为对照,男122人,女47人,均为汉族。所有纳入对象均为健康人群,且对检测指标均知情同意。②进行甘露糖结合凝集素外显子I52位密码子基因突变的序列特异性引物聚合酶链式反应检测。③计数资料差异比较采用χ2检验。结果:①回族人群100人,汉族人群169人,均进入结果分析,无脱落者。②回族中小学生100人,野生型为100人(100%);基因频率CGT为1。汉族人群169名汉族人52位密码子的野生型为161人(95.3%),突变杂合型为8例(4.7%),基因频率分别为CGT为0.9763;TGT为0.0237。回族中小学生甘露糖结合凝集素外显子I52位密码子基因度明显低于汉族人群(P<0.05)。结论:血清甘露糖结合凝集素外显子I52位密码子的点突变频率在不同的民族略有差异,汉族突变度显著高于回族。Peterslund NA,Koch C,Jensenius JC,et al.Association between deficiencyof m annose-binding lectin and severe infections after chem otherapy.Lancet2001;358(9282):637-8 Neth O,H ann I,Turner M W,et al.Deficiency of m annose-binding lectinand burden of infection in children with m alignancy:a prospective study.Lancet2001;358(9282):614-8 Kilpatrick DC.M annan-binding lectin:clinical significance and applications.Biochim Biophys Acta2002;1572(2-3):401-13 Steffensen R,Thiel S,Varm ing K,et al.Detection of structural gene m uta-tions and prom oter polym orphism s in the m annan-binding lectin(M BL)gene by polym erase chain reaction with sequence-specific prim ers.J Im-m unol M ethods2000;241(1-2):33-42 尹巧香,赵玉生,侯晓平,等.载脂蛋白基因多肽性与代谢综合征的关联[J].中国临床康复,2005,9(3):72-3 吴青,张红红,刘建伟,等.汉族人骨钙素基因多态性和骨质舒松的关系[J].中国临床康复,2005,8(30):6806-7

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